病毒保存：超低溫法

　　大多數(shù)微生物可用超低溫保存，超低溫保存法是適用范圍最廣的微生物保存法。需要復(fù)雜營養(yǎng)的微生物種，如用其他的貯存方法不能保持其活力( 如植物的病原性真菌)，通常可用超低溫的方法保存(ATCC 1983;Halliday，Baker 1985)。此法是將凍存在小管或安瓿里的細胞以較慢的冷凍速率(1℃/分鐘)冷凍，直至—150℃，再將這些小管貯存在—150～-196℃的液氮中。

　　超低溫的冷凍保護劑不同于凍干法所用的冷凍劑。ATCC 常用一種由甘油(10%)、二甲亞砜(5%)和培養(yǎng)液制成的混合劑保存多數(shù)的細胞株。這些化學(xué)試劑進入細胞內(nèi)可避免內(nèi)膜的冷凍損傷。貯存在低溫容器內(nèi)的細胞復(fù)蘇時必須小心操作。當小管被加熱時，所形成的冰晶會將細胞殺死，正確操作就可避免這種事故。只要迅速將樣品解凍就能減少活力的丟失，做法是：將封口的小管迅速放入37℃的水中，直至所有的冰融化，然后打開管口，將內(nèi)容物移入培養(yǎng)基。

　　超低溫保藏的微生物必須始終貯存在溫度非常低的環(huán)境中，因此需要液氮罐。在長期貯存的過程中必須經(jīng)常注意補充液氮。這種貯存方式比凍干法需要更多的經(jīng)費，包括為了維持貯存溫度所必要的勞動力和液氮等。

　　材料

　　病毒超低溫保存所需材料有：熱收縮塑料管，液氮罐，防護手套和面罩，永久性記號筆，氣體噴燈，裝液氮的保溫瓶。

　　方法

　　(1)剪一段兩端各超出冷凍管長度2cm 的熱收縮塑料管。

　　(2)將含有澄清病毒懸液(組織培養(yǎng)的上清培養(yǎng)基，或組織培養(yǎng)基內(nèi)的細胞溶解產(chǎn)物均可)冰浴幾分鐘，用滅菌移液管將0.2ml 冰浴過的上清懸液分裝到冷凍管內(nèi)，并將蓋子擰緊。

　　(3)將有病毒的冷凍管放入熱收縮塑料管中部，插入正確的標簽。

　　(4)用噴燈小心加熱熱收縮塑料管，并使之包住冷凍管。注意不要用太高的溫度加熱熱收縮塑料管。

　　(5)再小心加熱熱收縮塑料管的兩端，用大號鑷子夾緊管的端口至完全密封。

　　(6)將密封好的冷凍管快速在裝有液氮的保溫瓶中冷凍(操作時要求戴面罩和手套)。

　　(7)將冷凍過的冷凍管放入液氮罐中的格子內(nèi)，同時記錄樣品的詳細的存放位置、實驗編號和存放日期等。

　　(8)需要用時，迅速從液氮罐內(nèi)取出所需樣品，并投入37℃水浴箱中解凍后，用解剖刀片在冷凍管的硅化墊圈處切開熱收縮塑料管。擰開冷凍管的蓋子時不需要除去熱收縮塑料管。

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