單核細(xì)胞分離原理、方法及要點(diǎn)

　　單核細(xì)胞分離原理、方法及要點(diǎn):

　　基本原理：本文分離單核細(xì)胞所用方法是Percoll非連續(xù)性密度梯度離心法，主要是根據(jù)不同細(xì)胞間密度的差別進(jìn)行細(xì)胞分離。此法易操作，且使用通常的實(shí)驗(yàn)設(shè)備即可完成。

　　試劑與器材

　　1)外周血單個核細(xì)胞

　　2)1×PBS和10×PBS(無Ca2+、Mg2+，0.5mM EDTA)，胎牛血清(56℃，30分鐘加熱滅活)，HCl1mol/L。

　　Percoll分層液(密度=1.130g/ml,商品)，4g/L臺盼藍(lán)染液(溶解在PBS液中)。

　　3)50ml聚丙烯圓錐管，毛細(xì)吸管，移液管(1、2、10ml)。

　　4)CO2孵箱，超凈臺，有旋轉(zhuǎn)桶轉(zhuǎn)子裝置的離心機(jī)，PH計(jì)。

　　操作步驟——所有的操作應(yīng)該在無菌條件下進(jìn)行

　　(一)不同密度Percoll分層液的配制

　　1.Percoll分層液儲備液的制備：取未稀釋的Percoll原液(從瓶中取)9ml+1ml 10×PBS(無Ca2+、Mg2+)，用HCl 調(diào)節(jié)PH至7.4

　　2. Percoll分層液(Ⅰ)(密度=1.080g/ml)的配制：取Percoll儲備液3.12 ml(前一步配制)+1.88ml 1× PBS1(無Ca2+、Mg2+)

　　3. Percoll分層液 (Ⅱ)(密度=1.069g/ml)的配制：取Percoll分層液(Ⅰ)2.68 ml+2.32ml1×PBS( 無Ca2+、Mg2+)

　　4. Percoll分層液(Ⅲ)(密度=1.060g/ml)的配制：取Percoll分層液(Ⅱ)2.32 ml +2.68 ml1×PBS(無Ca2+、Mg2+)

　　(二)不連續(xù)密度梯度制備

　　1.將洗滌過的8×107外周血單個核細(xì)胞重新懸浮在2ml的Percoll分層液(Ⅰ)(密度=1.080g/ml)在這層液體的表面上輕輕鋪上2mlPercoll分層液(Ⅱ)(密=1.069g/ml)，后再于第二層液面上輕輕鋪上2ml的Percoll分層液(Ⅲ)(密度=1.060g/ml)

　　2. 20℃，在旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)子中1000×g離心上步所形成的密度梯度90分鐘(慢慢增加速度，無制動停轉(zhuǎn))。

　　(三)單核細(xì)胞的分離

　　1. 離心后單核細(xì)胞存在于Percoll分層液(Ⅱ)和(Ⅲ)(密度較小的部分)之間的界面中。

　　2. 用毛細(xì)吸管仔細(xì)收集單核細(xì)胞。

　　3. 用含1-5%胎牛血清的 1×PBS液洗滌細(xì)胞3次，4℃，400×g離心5分鐘，棄上清液。

　　4. 若需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞重新懸浮于培養(yǎng)基中。

　　5. 用臺盼藍(lán)拒染法測定細(xì)胞存活率。

　　結(jié)果：本法回收的細(xì)胞中單核細(xì)胞占70-100%(存活率應(yīng)大于90%)，淋巴細(xì)胞占0-20%，粒細(xì)胞占0-5%，紅細(xì)胞占0-7%，血小板小于0.5%。

　　實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)

　　1.為了得到較好的結(jié)果，外周血單個核細(xì)胞分離后應(yīng)立即使用。

　　2.所有操作過程應(yīng)在18-20℃中進(jìn)行。

　　3.仔細(xì)覆蓋各種Percoll分層液，避免破壞其界面。

　　4.洗滌分離細(xì)胞3次，以除去殘存的Percoll分層液和血小板。

　　5.如果所制備的細(xì)胞仍不純，可使用包被有抗CD2、抗CD3、抗CD19抗體分子的磁珠，以除去殘存的NK、T、B淋巴細(xì)胞。