冷凍干燥與液氮保藏菌種技術

　　建議用下列方法恢復培養(yǎng)冷凍干燥保藏的菌種。

　　一、安瓶管開封 ：

　　1.用浸過70%酒精的脫脂棉擦凈安瓿管。

　　2.用火焰將安瓿管頂端加熱。

　　3.滴無菌水至加熱的安瓿管頂端使玻璃開裂。

　　4.用挫刀或鑷子敲下已開裂的安瓿管的頂端。

　　二、菌株恢復培養(yǎng) ：

　　1.用無菌吸管，吸取0.3～0.5ml適宜的液體培養(yǎng)基，滴人安瓿管內，輕輕振蕩，使凍于菌體溶解呈懸浮狀。

　　2.取0.1～0.2ml菌體懸浮液，移植于適宜的瓊脂斜面/平板培養(yǎng)基上，剩余的菌液，注入適宜的液體培養(yǎng)基內，然后在建議的溫度下培養(yǎng)。

　　3.若未能活化，或活化后有疑問時，請于收到菌種1個月內，通知保藏中心，經查證無誤后，即免費補寄。

　　三、注意事項 ：

　　1.菌種活化前，請將安瓿管保存在6一10℃的環(huán)境下。

　　2.厭氧菌的培養(yǎng)，如無特別說明，自開封至接種完成，均需以無氧氣體充填，以保持厭氧狀態(tài)。

　　3.某些菌種經過冷凍干燥保存后，延遲期較長，需連續(xù)兩次繼代培養(yǎng)才能正常生長，此時請將步驟二(2)重復一次。

　　< 液氮超低溫保藏程序 >

　　1、容器的選擇：使用帶螺旋蓋的2ml塑料安培瓶。

　　2、檢查安培瓶是否滲漏：用0.05%的亞甲基藍水溶液在4℃浸泡30-45分鐘，沖洗干凈，棄去含有藍色染料的安培瓶，其余的安培瓶備用。

　　3、打印標簽(激光打印)。

　　4、容器的滅菌：先用蒸餾水漂洗干凈安培瓶，再用蒸餾水在滅菌鍋中121℃浸泡滅菌15分鐘，干燥并將打印好的標簽放入安培瓶中，略擰緊螺旋蓋，再行121℃滅菌30分鐘。

　　5、保藏菌菌齡：處于最大生長量階段或對數(shù)生長期后期。

　　6、保護劑：選用5-10%的甘油或二甲基亞砜作保護劑。

　　1)甘油的準備：在121℃滅菌15分鐘，2-8℃貯存。甘油一般以兩倍最終所需濃度的水溶液保存，然后與同等量的細胞懸液混合。若不用細胞懸液，則以最終所需濃度的水溶液保存。

　　2)二甲基亞砜：用0.22um的聚四氟乙烯過濾膜過濾除菌。過濾膜預先用甲醇和二甲基亞砜漂洗。無菌的二甲基亞砜以10-15ml裝量2-8℃避光保存。

　　7、分裝：在無菌條件下，將細胞懸液(從平板上打下直徑為5cm的菌塊)分裝于安培瓶中，并注入保護劑，擰緊螺旋蓋。 傳代細胞

　　8、將安培瓶固定在鋁夾上，貼好標簽。為了便于取用，一般一個鋁夾上僅放一個菌株。

　　9、將控溫系統(tǒng)先預冷到4℃，再將鋁夾放入其中。以每分鐘1℃降溫至-40℃，然后以每分鐘10℃降溫至-90℃。降溫以后，將鋁夾轉移至處于液氮中的儲存器中保存。

　　10、菌種的復活：將液氮保藏的菌種取出，迅速放入37℃水浴中解凍。一般需2至2.5分鐘,等完全解凍后，再及時轉接到合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。