兩種裂解液的成分和配制步驟

　　細(xì)胞裂解液的成分包括了Tris-HCl、EDTA 和NaCl。組織裂解液的成分主要是 Urea、thiourea、CHAPS 等。除了蛋白提取裂解液外，上述兩種裂解液在一些實(shí)驗中的用途也不可小覷。本文介紹這兩種裂解液的配方和配制過程。

　　組織裂解液配方：`

　　7M Urea(60. 06) 4.2042 g

　　2M thiourea(76.12) 1.5224 g

　　100mM DTT 0.1543 g

　　4% CHAPS 0.4 g

　　0.5mM EDTA 0.00146 g

　　40Mm Tris 0.0485 g

　　2%(v/v) NP-40 0.2 ml

　　1%(v/v) Triton X-100 0.1 ml

　　5mM PMSF用前加 0.00871 g

　　2%pharmalyte 0.2ml

　　共10ml分裝成400µl/每管(可應(yīng)用于30-80毫克組織裂解)

　　注：已配好分裝成400µl/每管可供應(yīng)用

　　不需另配!!!

　　細(xì)胞裂解液配方：

　　6M Urea(60. 06) 1.8018 g

　　2M thiourea(76.12) 0. 7613 g

　　65mM DTT 0.050 g

　　4% CHAPS 0.2 g

　　40Mm Trisbase 0.02425 g

　　共5ml分裝成200µl/每管(可應(yīng)用于50-100ml培養(yǎng)瓶內(nèi)的細(xì)胞裂解)

　　1、溶液準(zhǔn)備

　　2×樣品緩沖液：130mM Tris-HCl ( pH8.0 ) , 20% ( v/v ) 甘油 , 4.6% ( w/v ) SDS , 0.02% 溴酚藍(lán) , 2% DTT

　　PBS ( pH7.4 ) ：10mM Na2HPO4 , 1.8mM KH2PO4 , 50mM NaCl , 2.7mM KCl

　　RIPA緩沖液：50mM Tris-HCl(pH7.4) , 150mM NaCl , 1mM EDTA , 1%Triton×100 , 1%去氧膽酸鈉 , 0.1%SDS , 1mM PMSF , 1μg/ml 牛胰蛋白酶抑制劑 ( aprotinin ) , 1μg/ml亮抑蛋白酶肽 ( leupeptin )

　　裂解液緩沖液：10mM Tris-HCl(pH7.4) , 0.15M NaCl , 5mM EDTA(pH8.0) , 1%Triton×100;使用前加5mM DTT,0.1mM PMSF異丙醇和5mM ε-氨基己酸

　　2、裂解液的制備

　　制備細(xì)胞裂解液：

　　收集胰蛋白酶消化的細(xì)胞并離心，用PBS清洗。

　　用100μl RIPA緩沖液冰浴溶解沉淀10min(每500000個細(xì)胞20μl RIPA緩沖液)。

　　10000rpm，4℃離心10min，取上清轉(zhuǎn)移至新管。

　　用考馬斯亮藍(lán)法檢測蛋白質(zhì)濃度。

　　用裂解緩沖液將溶液濃度調(diào)到5mg/ml，每小瓶中放100μl，-80℃儲存。

　　按照1：1體積比混合2×樣品緩沖液，煮沸5min后，室溫放置5min。

　　短時離心后點(diǎn)樣電泳檢測。

　　制備組織裂解液：

　　在制備過程中一直將溶胞液或組織放在冰上。

　　切開組織，稱取組織1.5g于PBS中清洗。

　　在RIPA緩沖液中剪碎組織后，轉(zhuǎn)移到勻漿器中，加足5ml RIPA緩沖液，研磨20min。

　　將研磨液轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中，14000rpm，4℃離心10min。

　　取上清液作為完整的組織裂解液。

　　用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度。

　　用裂解緩沖液將溶液濃度調(diào)到5mg/ml，每小瓶中放100μl，-80℃儲存。

　　按照1：1體積比混合2×樣品緩沖液，煮沸5min后，室溫放置5min。

　　短時離心后點(diǎn)樣電泳檢測。

　　需要注意的是，為了減少以及杜絕核酸降解，樣品被徹底勻漿之前的步驟需要多加留意。還有就是短時離心后點(diǎn)樣電泳檢測。讓樣品從脫離原來的生存環(huán)境的時間盡量縮短