免疫濁度測定

　　免疫濁度測定(immunoturbidimetry)是將現(xiàn)代光學(xué)測量儀器與自動(dòng)化分析檢測系統(tǒng)相結(jié)合應(yīng)用于沉淀反應(yīng)，可對各種液體介質(zhì)中的微量抗原、抗體和藥物及其他小分子半抗原物質(zhì)進(jìn)行定量測定。當(dāng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，在二者比例合適時(shí)，在特殊的緩沖液中它們快速形成一定大小的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液體出現(xiàn)濁度。1959年Schultze等根據(jù)抗原抗體結(jié)合后形成的復(fù)合物能引起液體介質(zhì)出現(xiàn)濁度改變的原理，建立了透射比濁法(turbidimetry)，形成的濁度使光線的透過量減少，則光線被吸收的量與免疫復(fù)合物(immune complex，IC)形成量呈正相關(guān)，從而根據(jù)所測吸光度值即可推算出待測抗原的量。1967年Ritchie等利用激光照射在液相中的IC微粒上時(shí)部分光線發(fā)生散射的原理，通過測量散射光的強(qiáng)度來求得待測抗原的量，這種比濁測定稱為散射比濁法(nephelometry)。1977年Sternberg進(jìn)一步發(fā)展建立了速率散射比濁法(ratenephelometry)，成為目前定量測定微量抗原物質(zhì)并廣泛使用的一種高靈敏度、快速的自動(dòng)化免疫比濁測定法。免疫濁度測定可分為速率比濁法和終點(diǎn)比濁法兩種。

　　(一)免疫比濁測定的影響因素

　　1.抗原抗體的比例 抗原抗體的比例是濁度形成的關(guān)鍵因素，當(dāng)抗原和抗體的比例適當(dāng)時(shí)，二者全部結(jié)合，既無過剩的抗原，也無過剩的抗體，這時(shí)免疫復(fù)合物(1C)的形成和解離相等，其反應(yīng)式為：Ag+Ab—Ag·Ab。

　　當(dāng)抗原過量時(shí)，形成的IC分子小，而且會發(fā)生再解離，使?jié)岫确炊�下降，光散射亦減少，這就是高劑量鉤狀效應(yīng)(high does hook effect)。當(dāng)反應(yīng)液中抗體過量時(shí)，IC的形成隨著抗原遞增而增加，至抗原、抗體最適比例處達(dá)最高峰，這就是經(jīng)典的海德堡(Heidelberger)曲線理論。

　　因此，免疫比濁法的基本原理就是在反應(yīng)體系中保持抗體過量，如形成抗原過量則造成測定的準(zhǔn)確性降低。

　　2.抗體的質(zhì)量 免疫比濁測定法要求抗體的特異性強(qiáng)、效價(jià)高、親和力強(qiáng)，并使用R型抗體。

　　(1)抗體的特異性：抗血清最核心的要求是單價(jià)特異性，即該抗體只針對某一種抗原，與其他無關(guān)抗原不發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性抗體和相應(yīng)抗原結(jié)合后形成的濁度代表真實(shí)的試驗(yàn)結(jié)果。

　　(2)抗體的效價(jià)：低效價(jià)(<1：20)抗體會增加非特異性濁度(偽濁度)的產(chǎn)生。

　　(3)抗體的親和力：親和力是指抗體和抗原結(jié)合的牢固程度。親和力強(qiáng)則抗體的活性高，不僅可以加快抗原抗體反應(yīng)的速度，而且形成的IC較牢固，不易發(fā)生解離，這在速率比濁法中尤為重要。

　　(4)R型和H型抗體：根據(jù)抗血清來源的動(dòng)物種類不同，分為R型(rabbittype)抗體和H型(horsetype)抗體。R型抗體是指以家兔為代表的小型動(dòng)物被注射抗原免疫后制備的抗血清。這類抗血清的特點(diǎn)是親和力較強(qiáng)，抗原抗體結(jié)合后不易發(fā)生解離，H型抗體是指以馬為代表的大型動(dòng)物注射抗原后制備的抗血清，這類抗血清的親和力弱，抗原抗體結(jié)合后極易解離。

　　3.抗原抗體反應(yīng)的溶液 抗原抗體反應(yīng)液的最適pH為6.5—8.5，超過此限度則不易形成IC，甚至可引起IC解離。在一定范圍內(nèi)，離子強(qiáng)度大，IC形成快;離子的種類也可影響IC的形成，由慢到快依次為SCN—、ClO了、N03、Br—、Cl—、S(X—、H：P04和HPO擴(kuò)。因此，一般常使用磷酸鹽緩沖液作為免疫比濁法的反應(yīng)液。

　　4.增濁劑 某些非離子型親水劑對促進(jìn)IC的形成有顯著的增強(qiáng)作用，如聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)、吐溫-20(tween-20)，其作用是消除蛋白質(zhì)(抗原或抗體)分子周圍的電子云和水化層，促進(jìn)抗原、抗體分子靠近，結(jié)合形成大分子復(fù)

　　(二)免疫比濁方法分類

　　1.透射免疫比濁法 通過檢測光被吸收、衍射、反射和折射后光線減弱的變化，來定量抗原抗體的復(fù)合物。

　　2.散射免疫比濁法 通過檢測光折射和衍射而形成的散射光強(qiáng)度來定量抗原抗體的復(fù)合物。該法根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的時(shí)間和反應(yīng)結(jié)合的動(dòng)力學(xué)，又可分為終點(diǎn)散射比濁法、固定時(shí)間散射比濁法和速率散射比濁法。

　　3.免疫膠乳比濁法 是以膠乳作為載體對小分子免疫復(fù)合物進(jìn)行微量測定，進(jìn)一步提高了免疫濁度測定的靈敏度。