人凝血酶怎么制備

　　人凝血酶(human thrombin)是1種絲氨酸蛋白酶，主要功能在于將可溶性的纖維蛋白原水解成不溶性的纖維蛋白，因此在止血和凝血、組織修復(fù)和創(chuàng)傷愈合等方面有重要作用[1，2]。正常情況下，人血液循環(huán)中的凝血酶以非活化的形式存在，即凝血酶原，通過(guò)水解酶作用，主要轉(zhuǎn)換成具有活化形式的α�材�血酶，此外還有β�埠挺锚材�血酶[3]。α�材�血酶在凝血酶中含量>97%，由1條3 kD的輕鏈和另1條31 kD的重鏈通過(guò)二硫鍵連接而成，具有廣泛的生理學(xué)活性，如水解纖維蛋白原形成纖維蛋白凝塊，參與凝血因子Ⅴ和Ⅷ的激活，通過(guò)激活因子��起到穩(wěn)定纖維蛋白的作用，在凝血酶原激酶作用下起到激活蛋白C的抗凝血作用;此外，它還通過(guò)激活血小板上的凝血酶受體來(lái)刺激血小板的聚集[4]。由于凝血酶在止血與凝血、組織修復(fù)等方面起到極大的作用，已成為國(guó)內(nèi)外研究的焦點(diǎn)。我們現(xiàn)就人凝血酶的制備技術(shù)、病毒滅活及相關(guān)應(yīng)用研究綜述如下。

　　制備技術(shù)

　　1.1 固定化肝素親和層析 Nordenman等[5]將固定化肝素的瓊脂糖凝膠用于人凝血酶的分離純化，從電泳結(jié)果可知該方法制備的人凝血酶純度較高。國(guó)外有研究者以新鮮血漿做原料，經(jīng)蛇毒激活凝血酶原和肝素�睸epharose CL��6B親和層析柱后，1 L血漿可獲得純度>97%、比活性為4 600 IU/mg的α�材�血酶25 mg[6]。陳紅兵等[7]通過(guò)凝血酶原提取、激活和肝素�睸epharose CL��6B親和層析等步驟，從枸櫞酸鹽抗凝血漿中分離出回收率為87%，比活性達(dá)到4 715 IU/mg的人凝血酶。這些報(bào)道表明，用肝素親和層析分離人凝血酶，不僅可獲得高純的制劑，同時(shí)可簡(jiǎn)化制備步驟和縮短分離純化時(shí)間。但是由于親和凝膠價(jià)格昂貴，到目前為止尚未用于凝血酶的大規(guī)模制備。

　　1.2 離子交換層析 近年來(lái)，由于具有快速、選擇性好及特別適于大體積樣品純化等優(yōu)點(diǎn)，離子交換層析在人凝血酶的分離純化中得到廣泛使用。Zhigniew等[8]用SP�睸pherodex陽(yáng)離子交換層析對(duì)富含凝血酶的原料分離純化，結(jié)果表明該類交換劑對(duì)凝血酶有很好的選擇性，純化后的牛凝血酶和人凝血酶的酶活力分別達(dá)到2 300和1 150 IU/mg，2種凝血酶的回收率都達(dá)到了70%—90%。孫文種等[9]用CM�睸epharose陽(yáng)離子交換層析從Nitschmarm組分B中分離凝血酶，經(jīng)分離后凝血酶比活為195 IU/mg，回收率77.9%。Catherine等[10]以冷沉淀上清為原料，先用DEAE�瞫ephadex A50 吸附得到57.5 IU/ml凝血酶原復(fù)合物，然后用CaCl2激活獲得345 IU/ml的凝血酶，并將凝血酶上SP�睸epharose F.F.陽(yáng)離子交換柱，最終得到凝血酶的比活性為1 150 IU/mg。安康等[11]為從Cohn組分Ⅲ中獲取人凝血酶，依次用PEG沉淀、DEAE�瞫ephadex A50離子交換層析和SP�睸epharose F.F.層析等步驟，最后制得純度和比活性較高的制品，現(xiàn)已上市。Amal等[12]以凝血酶原激酶激活的富含凝血酶的血漿上清為原料，用DEAE�睸epharose陰離子交換劑做初步純化后，進(jìn)一步用CM�睸epharose陽(yáng)離子交換分離，制備出超高純的凝血酶，其凝血酶的比活性為(9 200—12 650)IU/mg。由于離子交換層析具有操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，成本相對(duì)較低等優(yōu)點(diǎn)，使得凝血酶規(guī)�；�生產(chǎn)成為現(xiàn)實(shí)。

　　1.3 多重色譜層析聯(lián)用 從已有的文獻(xiàn)報(bào)道來(lái)看，制備人凝血酶的原料有冷沉淀上清、Cohn 組分Ⅲ和凝血酶原復(fù)合物等;但這些原料中除了人凝血酶原外，還含有具有治療意義的其它血漿蛋白，如FⅨ、蛋白C，采用單一原理層析法制備人凝血酶時(shí)，無(wú)法使這些有益成分得到綜合利用。為此，國(guó)外有公司根據(jù)各血漿蛋白的理化性質(zhì)的差異，采用不同原理的色譜聯(lián)用方法來(lái)分離純化凝血因子。以冷沉淀上清為原料，分別采用DEAE陰離子交換層析、Heparin�睸epharose F.F.親和層析和金屬螯合層析分離出凝血酶原和FⅨ，將凝血酶原激活后，再用疏水層析純化出人凝血酶。此方法不僅能制備出高比活性的凝血酶，而且能同時(shí)分離出其它的凝血因子(如FⅨ)，所制備的凝血酶比活性為2 400 IU/mg，遠(yuǎn)高于Baxter公司的Tisseel制品(7.5 IU/mg)和OMRIX公司的Quixil制品(184 IU/mg)，而且這樣的生產(chǎn)工藝可整合生產(chǎn)流程，降低生產(chǎn)費(fèi)用，最終達(dá)到提高血漿蛋白的利用率的目的。但就目前來(lái)看，該分離方法存在生產(chǎn)工藝復(fù)雜、成本過(guò)高等缺點(diǎn)，短期內(nèi)鮮有規(guī)�；�生產(chǎn)的可能。