免疫磁珠方法分選細(xì)胞步驟

　　用免疫磁珠做細(xì)胞分選(MACS)是高效簡捷的免疫細(xì)胞及其它細(xì)胞的分離純化方法。 原理是已包被一抗的磁珠與細(xì)胞表面相應(yīng)分子特異性結(jié)合，或者已包被二抗(羊抗小鼠或羊抗大鼠)的磁珠與預(yù)先已與細(xì)胞表面分子特異結(jié)合的一抗結(jié)合。磁珠攜帶與之結(jié)合的細(xì)胞吸附于分離柱/試管上，實(shí)現(xiàn)…

　　用免疫磁珠做細(xì)胞分選(MACS)是高效簡捷的免疫細(xì)胞及其它細(xì)胞的分離純化方法。

　　原理是已包被一抗的磁珠與細(xì)胞表面相應(yīng)分子特異性結(jié)合，或者已包被二抗(羊抗小鼠或羊抗大鼠)的磁珠與預(yù)先已與細(xì)胞表面分子特異結(jié)合的一抗結(jié)合。磁珠攜帶與之結(jié)合的細(xì)胞吸附于分離柱/試管上，實(shí)現(xiàn)陽性細(xì)胞分離或陰性細(xì)胞的分離。本節(jié)介紹超微磁珠間接標(biāo)記、用分離柱陽性分選細(xì)胞的方法。

　　Protocal：

　　1.離心收集待分離細(xì)胞，用少量PBE孵育液(0.5%BSA、0.08%EDTA PH7.2 PBS，真空抽濾除菌及液體內(nèi)氣體)充分混懸細(xì)胞(0.5ml/1×108細(xì)胞)，加入一抗(10~20μg/ml終濃度)，4° C孵育30分鐘。

　　2.用20倍體積PBE洗細(xì)胞一次，再加PBE(0.3ml/1×108細(xì)胞)充分混懸細(xì)胞后，加入相應(yīng)二抗包被的超微磁珠，混勻后置8~15° C孵育10~15分鐘。

　　3.將分離柱安裝入磁場中，加入0.5ml PBE，在重力作用下自然流盡，以預(yù)處理分離柱。

　　1.如果分離細(xì)胞用作培養(yǎng)，全過程在超凈臺中完成。

　　2.超微磁珠及微小磁場系統(tǒng)適合于少量細(xì)胞分離(如106-107)，通常已適用于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)研究;此外各公司尚有大磁珠及大磁場供應(yīng)，可用于更大量細(xì)胞的分選;除分離柱外，也有試管及其它設(shè)備用于分選;根據(jù)我們應(yīng)用的經(jīng)驗(yàn)，分離柱由于提供了較大的接觸面，在細(xì)胞分選上具有較多優(yōu)點(diǎn)。磁場也可以自制，用一般的磁鐵即可做成簡易磁場，可提供足夠的磁力。

　　3.磁珠分離系統(tǒng)分離的細(xì)胞純度可以達(dá)到80~99%，得率在60~90%左右，僅次或相當(dāng)于流式細(xì)胞儀(FACS)的分選效率，與FACS 相比，MACS設(shè)備簡單，耗時極短，故而應(yīng)用廣泛。MACS也可用做FACS分選前的預(yù)分離，以減少FACS所用時間。另外連續(xù)兩次過柱分選可進(jìn)一步提高分選細(xì)胞純度，通�？蛇_(dá)95-99%。

　　4.在分離柱尾接上限速針頭，收集的首次流下的細(xì)胞即為陰性選擇細(xì)胞，一般純度低于陽性選擇。

　　5.分離柱一般只能一次應(yīng)用，再用時降低分離效率;

　　6.分選下的細(xì)胞可用熒光標(biāo)記抗體(一抗或二抗)標(biāo)記后FACS鑒定純度;我們用熒光抗體直接標(biāo)記細(xì)胞后，用二抗包被磁珠分選出細(xì)胞，直接做FACS分析，也可實(shí)現(xiàn)分選和純度檢測。

　　7.陽性選擇后，如需用第二種表面標(biāo)志繼續(xù)分離，可以用剪切酶剪切下之結(jié)合的磁珠和一抗，再次進(jìn)行下一輪分選。如需進(jìn)行細(xì)胞功能分析，也可經(jīng)培養(yǎng)12~24小時，使結(jié)合的磁珠脫落后進(jìn)一步使用陽選的細(xì)胞做研究。

　　分選的效率在很大程度上取決于實(shí)驗(yàn)者對關(guān)鍵環(huán)節(jié)的把握。我們建議實(shí)驗(yàn)者在操作前認(rèn)真閱讀相應(yīng)的說明書及以下特別值得提出引起重視的有以下幾點(diǎn)：

　　1.待分選細(xì)胞中如有貼壁細(xì)胞，建議在分選前先貼壁培養(yǎng)去除，或者提高EDTA濃度;

　　2.抗體包被磁珠對死細(xì)胞常有非特異性結(jié)合。因而分選前去除死細(xì)胞;

　　3.新鮮分離骨髓細(xì)胞，先用膠原酶、DNA酶、胰酶聯(lián)合消化，可使細(xì)胞團(tuán)塊解聚，從而提高分離效率。

　　4.上分離柱前，充分振蕩，混懸細(xì)胞，打散細(xì)胞團(tuán)塊;

　　5.用分離柱分選，應(yīng)用真空抽濾水，減少水中氣泡，使分離柱不被氣泡阻滯;

　　6.細(xì)胞懸液加入分離柱中時，應(yīng)將滴管伸至底壁后加入，避免將細(xì)懸液沿管壁流入，使管壁殘流末分選細(xì)胞，以致后繼洗柱過程中，因疏忽末被洗下，最后導(dǎo)致純度不高。洗柱時，應(yīng)在前次液體充分流盡后，再加洗液。

　　7.分選細(xì)胞量應(yīng)根據(jù)說明書控制，不超量;

　　8.孵育時間和溫度應(yīng)按說明書進(jìn)行，延長孵育時間、提高溫度會增加非特異結(jié)合;

　　9.先用抗體阻斷Fc受體，可降低非特異性結(jié)合;