質(zhì)粒DNA的分離、純化

　　所有分離質(zhì)粒DNA的方法都包括三個基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增;收集和裂解細(xì)菌;分離和純化質(zhì)粒DNA。

　　1、堿裂解法原理:本實驗采用 堿裂解法 進(jìn)行質(zhì)粒的小量制備。十二烷基磺酸鈉( SDS SDS)是一種陰離子表面活性劑，它既能使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性。

　　用SDS 處理細(xì)菌后，會導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞破裂，釋放出質(zhì)粒DNA 和染色體 DNA 。兩種 DNA 在強堿環(huán)境都會變性。

　　當(dāng)加入 pH4.8 的酸性乙酸鉀降低溶液 pH 值后，質(zhì)粒 DNA 將迅速復(fù)性，而染色體 DNA 分子巨大，難以復(fù)性。

　　通過離心，大部分細(xì)胞碎片、染色體 DNA 、RNA 及蛋白質(zhì)沉淀( SDS 的作用下 )除去，而質(zhì)粒 DNA 留在上清中 。

　　再用異丙醇沉淀、乙醇洗滌，可得到純化的質(zhì)粒 DNA 。

　　2、實驗材料、主要儀器和試劑

　　(1)材料：含有質(zhì)粒PBLG的大腸桿菌DH5α

　　(2)儀器：塑料離心管架(30孔);10、100、1000μL微量加樣器;1.5mL塑料離心管(又稱EPPendorf離心管);低溫高速離心機(20 000 r/min)一臺;無菌工作臺;高壓鍋;常用玻璃儀器及滴管等。

　　(3)試劑：LB培養(yǎng)基成分如下：每升含有胰蛋白陳10g，酵母提取物5g，NaCI10g，瓊脂糖或瓊脂(固體培養(yǎng)基時用)15g，用NaOH調(diào)pH至7.0;pH8.0 GET緩沖液(50mmol葡萄糖，10mmol/L EDTA，25 mmol/L Tris-HCl);0.2mol/L NaOH(內(nèi)含1%的SDS)，注：臨用時配;pH4.8乙酸鉀溶液(60mL 5mol/L KAc，11.5mL冰醋酸，28.5mL H2O)：該溶液鉀離子濃度為3mol/L，醋酸根離子濃度為5mol/L;異丙醇;70%乙醇;pH8.0 TE緩沖液：10 mmol/LTris-HCI，lmmol/L EDTA，其中含RNA酶20ug/mL。

　　3、操作步驟

　　1)培養(yǎng)細(xì)菌將大腸桿菌PBLG接種在LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12h，挑一個菌斑接種在液體LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12～16h。

　　2)從菌落中快速提取制備質(zhì)粒DNA

　　(1)在無菌工作臺上取1.5mL菌液加入EPPendorf離心管中，轉(zhuǎn)速10000r/min，離心lmin，去掉上清液(注意，一定要吸干上清液)。加入150μlGET緩沖液，充分混勻，在室溫下放置10min。

　　注：溶菌酶在堿性條件下不穩(wěn)定，必須在使用時新配制溶液。使用EDTA是為了去除細(xì)胞壁上的Ca2+，使溶菌酶更易與細(xì)胞壁接觸。

　　(2)加入200μl新配制的0.2mol/LNaOH(內(nèi)含1%SDS)。加蓋，顛倒2～3次，使之混勻，冰上放置5min。

　　注：SDS能使細(xì)胞膜裂解，并使蛋白質(zhì)變性。

　　(3)加入150μl冰冷的乙酸鉀溶液(pH4.8)。加蓋后顛倒數(shù)次使混勻，冰上放置3-5min。

　　(4)用低溫高速離心機，轉(zhuǎn)速為10000r/min，離心5min，上清液倒入另一干凈的離心管中。

　　注：乙酸鉀能沉淀SDS和SDS與蛋白質(zhì)的復(fù)合物，在冰上放置5min是為了沉淀完全。如果上清液經(jīng)離心后仍混濁，應(yīng)混勻后再冷卻至0℃重新離心。

　　(5)另取一個Eppendorf管，轉(zhuǎn)入上清，并加等體積異丙醇，混勻，室溫放置5min，12000r/min離心5min，棄去上清液。

　　(6)加入200μl無菌蒸餾水溶解沉淀，再加入1/2體積7.5mol/L NH4Ac，混勻后冰浴3～5min，以12000r/min離心5min。

　　(7)轉(zhuǎn)移上清至新管中，并加入等體積異丙醇或2倍體積無水乙醇，室溫放置5min后以12000r/min離心30min。棄去上清。

　　(8)沉淀用70%乙醇洗滌一次，小管倒置于吸水紙上，除盡乙醇，室溫自然干燥。

　　(9)加入20μlTE，使DNA充分溶解，置-20℃貯存,待用。