離心機(jī)在免疫細(xì)胞上的應(yīng)用

　　免疫細(xì)胞分離辦法：

　　1、淋巴細(xì)胞的分離

　　取肝素抗凝血1m1 加Hanks 液1m1 稀釋后，沿管壁徐徐滴流疊加盛有2m1 淋巴細(xì)胞分離液的試管內(nèi)(注意勿與分離液混合，然后2000r/min 水平離心20min，管內(nèi)分為4 層，自上而下依次為血漿，單個(gè)核細(xì)胞，顆粒白細(xì)胞、紅細(xì)胞(圖2—1)。用毛細(xì)管伸至單個(gè)核細(xì)胞層中(位于細(xì)胞分離液與血漿的界面上)，沿管壁輕輕吸出全部細(xì)胞。然后用Hanks 液洗兩次，每次2000r/min 離心10min，最后用RPMI l640 培養(yǎng)液將細(xì)胞配成2×106/m1 的細(xì)胞懸液備用。

　　2、T 細(xì)胞及B 細(xì)胞的分離

　　將淋巴細(xì)胞懸液通過尼龍棉柱，B 細(xì)胞粘附于尼龍棉上，T細(xì)胞則不粘附，先用RPMI l640 培基洗脫尼龍棉柱，流下的細(xì)胞懸液含有豐富的T 細(xì)胞。然后用力反復(fù)擠壓尼龍柱、擠出粘附在尼龍棉上的B 細(xì)胞，并用少量的RPMI l640 培基洗脫，此細(xì)胞懸液含有豐富的B 細(xì)胞。尼龍柱(塑料管)的長短和尼龍棉的多少，視分離細(xì)胞的多少而定。

　　3、CD4 細(xì)胞及CD8 細(xì)胞的分離

　　(1)CD4 細(xì)胞的分離：將一定量的T細(xì)胞懸液通過一根SephDdexC—10 柱，然后用少量的RPMll640 培養(yǎng)洗滌，收獲的細(xì)胞懸液約含85%的CD4 細(xì)胞。

　　(2)CD8 細(xì)胞分離：用Tris 緩沖液稀釋羊抗鼠IgG(濃度為10μg/m1)包被一平皿表面，然后放置4℃，沒有包被上的抗體用PBS 洗凈。然后將已標(biāo)記有抗CD8 單克隆抗體的T 細(xì)胞(細(xì)胞濃度為1×l07/m1)3m1 加入上述的平皿內(nèi)，4℃放置2 小時(shí)，用PBS 輕輕洗凈末粘附的細(xì)胞，然后用毛細(xì)管加入10m1 PBS 吹打。收集的脫落細(xì)胞經(jīng)洗滌后懸浮在RPMI l640 培基中備用。CD4 細(xì)胞亦可用此法分離。

　　4、單核巨噬細(xì)胞的分離

　　單核巨噬細(xì)胞有粘附塑料或玻璃表面的特性，而淋巴細(xì)胞則無此特性，借此可將這兩類細(xì)胞分開，其方法簡述如下。將待分離的細(xì)胞懸液(如實(shí)物動物的腹腔液)加入適當(dāng)大小的塑料或玻璃平皿內(nèi)，置于37℃ C02 溫箱內(nèi)溫育1 小時(shí)，然后用RPMI 1640 培基輕輕漂洗平皿表面，去除非粘附細(xì)胞，再將粘附有細(xì)胞的平皿表面用上述培基輕輕洗刷，收集粘附的單核巨噬細(xì)胞。如果要獲得純度較高的單核巨噬細(xì)胞，可重復(fù)上述過程。