高速離心機(jī)分離的幾種方法

　　制備型超高速離心機(jī)的幾種分離方法：

　　A.差速離心：逐次增加離心力，每次可沉降樣品溶液中的一些組份。

　　差速離心是一種最常用的方法。在這種方法中，離心管在開始時(shí)裝滿了均一的樣品溶液。通過在一定速度下一定時(shí)間的離心后，就可得到兩個(gè)部份：沉淀和上清液。

　　通常在第一次離心時(shí)把大部分不需要的大粒子沉降去掉。這時(shí)所需的組份大部分仍留在上清液中。然后將收集到的上清液以更高速度離心，把所需的粒子沉積下來。離心的時(shí)間要選擇得當(dāng)，使大部份不需要的更小的粒子仍留在上清液中。對(duì)于得到的沉淀和上清液可以進(jìn)行進(jìn)一步的離心，直到達(dá)到所需要的分離純度為止。

　　差速離心的特點(diǎn)是操作簡單，但分離純度不高。

　　B.密度梯度離心法：可以同時(shí)使樣品中幾個(gè)或全部組份分離，具有很好的分辨率。

　　1)速率區(qū)帶法(rate zonal)：

　　根據(jù)樣品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速度(S)。大致步驟如下：

　　在離心管中裝入密度梯度溶液，溶液的密度從離心管頂部至底部逐漸增加(正梯度)。

　　將所需分離的樣品小心地加至密度梯度溶液的頂部。樣品在梯度溶液表面形成一負(fù)梯度。

　　由于不同大小的粒子在離心力作用下，在梯度中移動(dòng)的速度不一樣，所以經(jīng)過離心后會(huì)形成幾條分開的樣品區(qū)帶。

　　注意：樣品粒子的密度必須大于梯度液注中任一點(diǎn)的密度。離心過程必須在區(qū)帶到達(dá)管子底部前停止。

　　2)等密度離心法(isopycnic)：

　　根據(jù)粒子的不同密度來分離。離心過程中，粒子會(huì)移至與它本身密度相同的地方形成區(qū)帶。

　　密度樣度的選擇要使梯度的范圍包括所有待分離粒子的密度。樣品可以在密度梯度液粒上面或均勻分布在密度梯度中。經(jīng)離心后，樣品粒子達(dá)到它們的平衡點(diǎn)。注意：平衡后粒子的分離完全由其密度決定，與時(shí)間無關(guān)，此時(shí)再改變離心轉(zhuǎn)速，只能改變區(qū)帶的相對(duì)位置。 2.密度梯度分析法

　　1)梯度介質(zhì)性質(zhì)與選擇：

　　A、應(yīng)具備的性質(zhì) ：

　　梯度物質(zhì)的選擇原則是滿足分離方法的基本要求，一個(gè)理想的密度材料標(biāo)準(zhǔn)它應(yīng)是：

　　· 所形成的溶液密度應(yīng)包括所需要的密度范圍。

　　· 具有某些性質(zhì)，如折射率，據(jù)此可測定它的濃度。

　　· 所形成的溶液粘度低。

　　· 不損傷所分離的樣品。

　　· 離心分離后容易除去。

　　· 不妨礙分離積分的分析。

　　B、常用介質(zhì)種類：

　　表一、常用梯度材料在20℃密度

　　B.梯度介質(zhì)應(yīng)用范圍：

　　表二、等密度梯度介質(zhì)的應(yīng)用

　　+++很好 ++好 +可以 --不適用

　　表三、各種大分子在蔗糖梯度液中的大約密度

　　2、梯度溶液的準(zhǔn)備：

　　計(jì)算

　　稀釋(本文第三章第一部分)

　　(3)、梯度形狀

　　梯度形狀分：線型、等速型、階梯型、平坦型、陡峭型指數(shù)梯度。(如下圖)

　　梯度形狀對(duì)于分離是否成功非常重要：

　　最常用的是線型梯度，適用于分離蛋白質(zhì)、酶、激素、核糖體亞基和一些植物病毒;等速型適用于分離脂蛋白和一些需上浮分離樣品;不連續(xù)或階梯型梯度最適用于分離整細(xì)胞、亞細(xì)胞組分以及純化一些哺乳類動(dòng)物病毒或昆蟲病毒。等速梯度以及長液柱可增進(jìn)分離能力，適用于分離核糖體亞基、多核糖體及植物病毒。

　　B.梯度柱制備：

　　梯度液柱可以用手工或梯度儀制備

　　半注法：

　　為縮減離心時(shí)間，或分離樣品較少可用半注法：下半管鋪置梯度介質(zhì)，中間加樣品，上面鋪Buffer或液體石臘油。

　　(4)、加樣方法與加樣量：

　　將樣品加到梯度液柱上，針尖和離心管成45-60°角度，慢慢地將樣品沿管壁流到液面上去，對(duì)于DNA一類易斷的脆弱樣品，應(yīng)該用孔徑較大的移液管代替針頭，以避免剪切力對(duì)樣品的切割作用。樣品濃度是梯度柱最小密度的1/10(W/W)。

　　(5)、轉(zhuǎn)子的選擇與效應(yīng)：

　　(6)、分離區(qū)帶的回收及檢測

　　離心后所形成的區(qū)帶樣品的回收方法基本有四種：

　　a.穿刺法

　　穿刺離心管底部，使梯度溶液滴出，將一具有合適閥門的蓋帽放在離心管頂，可控制滴出速度。

　　b.虹吸法：

　　將一毛細(xì)管輕輕插入管底，盡量防止梯度抖動(dòng)，用微量泵逐漸滴取，以一定量滴數(shù)或體積部分收取。

　　c.加壓法：

　　通過一針管將高密度的液體泵入到梯度離心管的底部，部分收集換出的溶液。

　　d.切割法：

　　采用專用的切割刀切割所需區(qū)帶。

　　區(qū)帶檢測：

　　所謂區(qū)帶檢測，實(shí)際上是對(duì)水平轉(zhuǎn)子或角轉(zhuǎn)子和垂直轉(zhuǎn)子離心管中的分離物質(zhì)所做的監(jiān)測，通常只是測量在260或280mm時(shí)長的吸收值，以決定梯度中的核酸或蛋白的整個(gè)分布，這個(gè)操作通常稱之為在線(on line)監(jiān)測。