胚胎干細胞培養(yǎng)操作規(guī)程

　　維持ES細胞處于未分化狀態(tài)：

　　ES細胞培養(yǎng)用含有 ESGRO(白血病抑制因子)的高糖培養(yǎng)基來阻止細胞的分化。為細胞提供包被有0.1%明膠的平板作為粘附細胞的基質。建議每2-3天從達到 80%-90%融合的平板按1：8的比率傳代細胞一次，細胞傳代以后，在將細胞接種在0.1%明膠包被的培養(yǎng)皿之前，通過預先將細胞接種在沒有經過包被的組織培養(yǎng)板2個小時，使分化細胞粘附，從而將分化和未分化細胞分開。將細胞全程置于37℃，5%CO2，100%濕度條件下培養(yǎng)。

　　培養(yǎng)基：ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液(該溶液也能用于EB培養(yǎng)基--見下文)。分裝在50ml FALCON管中，(稀釋為2×，每管42ml)，貯存在-20℃。通過將21ml該溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制備培養(yǎng)基，0.2μm濾膜過濾。貯存于4℃。

　　注：一瓶DMEM是500ml。

　　貯存液：DMEM(高糖)、馬血清(HS)、L-谷氨酰胺(200mM)、MEM NEAA(10mM)、HEPES(1M)、β-巰基乙醇(55Mm)、PEST、ESGRO。

　　復蘇細胞：細胞被凍存在10%二甲基亞砜(DMSO)中防止結晶的形成，結晶的形成會損害細胞。然而，二甲基亞砜對細胞有毒性，快速的進行細胞復蘇是很重要的。

　　操作步驟：

　　1.從液氮中取出一管細胞;

　　2.將凍存管置于37℃水浴中2分鐘(或放到管內溶液恰好完全溶解);

　　3.將細胞轉移到一15ml Falcon管中;

　　4.加入5ml ES培養(yǎng)基(用培養(yǎng)基沖洗凍存管);

　　5.離心3分鐘;

　　6.棄上清，用2ml ES培養(yǎng)基重懸細胞，至少吹打10次;

　　7.接種在明膠包被(見下文)的6孔或6cm組織培養(yǎng)皿;

　　8.孵育。

　　凍存細胞

　　凍存液：90%HS和10%二甲基亞砜

　　步驟：

　　1.1×PBS洗細胞并留少許PBS在培養(yǎng)皿內;

　　2.用細胞刮刀收集細胞;

　　3.將細胞轉入15ml Falcon管內并離心3分鐘;

　　4.棄去上清并將細胞重懸于冷的凍存液中(10cm的培養(yǎng)皿用2ml，15cm的培養(yǎng)皿用6-7ml。)

　　5.分裝于凍存管內，每管1ml;

　　6.置-80℃過夜，第二天移入液氮。

　　明膠包被：準備500ml 0.1%明膠溶液

　　1.將0.5g明膠溶解在500ml無鈣鎂的PBS中(50-65℃水浴15～30分鐘)。

　　2.最好在溶液沒有冷卻的情況下通過0.2μm濾膜過濾，貯存在4℃。

　　包被培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿

　　1.加入足量的明膠溶液覆蓋培養(yǎng)平面(15cm培養(yǎng)皿加2ml，10cm培養(yǎng)皿加0.5～1ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆蓋培養(yǎng)表面就行了。);

　　2.置室溫30分鐘;

　　3.去除明膠溶液，將培養(yǎng)板貯存在包裝袋中室溫放置，最好將板子平方，以免明膠污染蓋子和流出培養(yǎng)板。