免疫膠體金的操作程序和優(yōu)點

免疫膠體金-銀染色(immunogold-sliverstaining)技術(shù)系20世紀80年代Holgate將免疫金染色和銀顯影方法結(jié)合而建立的一種新型檢測技術(shù)，亦可用于電鏡包埋前染色。其基本原理是先進行免疫膠體金染色標記抗原，使其結(jié)合在組織細胞抗原所在位置，然后進行物理顯影，當顯影劑中的對苯二酚將銀離子還原成銀原子時，后者將圍繞金顆粒形成一個“銀殼"。“銀殼"本身亦具有催化作用，進一步促使更多銀離子還原，則使“銀殼"越來越大，抗原位置因此而變得清晰，抗原信號也得以放大，故此法是最為敏感的細胞化學(xué)方法之一。因金顆粒的電子密度高，加之敏感性也高，故特別適合免疫電鏡的抗原研究。

主要操作程序如下：
1.組織固定后，5%、10%和20%系列濃度的蔗糖處理，制作冰凍切片，厚10～30gm；
2.含1%正常羊血清或1%BSA的PBS室溫孵育20分鐘，封閉抗體非特異性結(jié)合部位；
3.含1%氫硼化鈉的PBS孵育20分鐘；
4.第一抗體孵育，可先置4℃，12～18小時，然后室溫1小時，使抗體充分滲透并結(jié)合；
5.PBS漂洗3次，每次5分鐘；
6.0.1% BSA/PBS液(pH 8.2)漂洗5分鐘，為膠體金結(jié)合提供堿性環(huán)境；
7.膠體金標記的第二抗體(pH 8.2)室溫孵育30～45分鐘，需摸索最佳稀釋度；
8.硝酸銀液避光處理2―10分鐘，顯影時間最好根據(jù)實驗結(jié)果確定；
硝酸銀液配制：雙蒸水60ml，枸櫞酸緩沖液10ml，對苯二酚1.0g溶于30ml雙蒸水，將三者混合，完全溶解后，用前入硝酸銀液2.0ml(含35mg硝酸銀)混勻；
枸櫞酸緩沖液的配制：枸櫞酸(C6 H8O-7H2 O)25. 5g，枸櫞酸三鈉(NaC6H5O7 2H2 0)23.5g，用雙蒸水溶解至100ml，即為pH 3.5的枸櫞酸緩沖液。
9.解剖顯微鏡下選取免疫反應(yīng)陽性部位。1%OsO4后固定30分鐘，雙蒸水漂洗；
10.組織標本的脫水、樹脂包埋、超薄切片制作及電鏡觀察等方法同前述。

主要優(yōu)點：該方法形成的金銀顆粒電子密度高，反差強，敏感度高；包埋前染色的標本可在解剖顯微鏡下選取陽性部位，結(jié)合半超薄切片的應(yīng)用，能明顯提高工作效率，特別適于抗原含量少的組織細胞的免疫電鏡研究。缺點：顯影處理需在暗室進行，操作較繁瑣；而且增加包埋前免疫染色處理的步驟易導(dǎo)致非特異性著色；另外，單個金顆粒周圍結(jié)合的銀粒子不甚牢固，漂洗等處理容易脫離，半定量研究時應(yīng)注意；此外銀等廢液直接流人下水道，容易導(dǎo)致環(huán)境污染。